Окраска цитологических мазков

Окраски по Алексееву. Ответ дается уже через 5– 10 минут. Метод Алексеева предусматривает ускоренную обработку цитологических препаратов азурэозиновыми смесями по принципу Романовского с целью получения привычной цитологической картины.Методика приготовления препаратов.

Обработка препаратов может производиться двумя способами:

1. Предметные стекла с высохшими на воздухе препаратами в количестве 3 – 5штук, укладывают на полочку для окраски отпечатками или мазками кверху. Глазной пипеткой на каждый препарат наносят раствор краски Романовского–Гимзы в количестве 5 – 8капель. Краска должна покрыть весь мазок или отпечаток. В таком состоянии препарат оставляют на 60 секунд, в течение которых он фиксируется метанолом, входящим в состав краски, и частично окрашиваются его элементы. Затем к краске на предметных стеклах добавляют 10 – 16 капель нейтральной дистиллированной воды, нагретой до 50 – 60° и покачиванием смешивают краску с водой. Препарат оставляют на l– 2минуты. Затем струей нейтральной дистиллированной воды из колбы-промывалки, не сливая, омывают краску с препарата. Остаток воды сливают и препарат просушиваютфильтровальной бумагой. Окрашенный препарат просматривают под микроскопом сначала с малым увеличением, а при нахождении подозрительных мест переходят на иммерсионный объектив. Остальные мазки оставляют залитыми краской на 3 – 5минут на тот случай, если первый препарат окажется бледно окрашенным. Первым обычно красится самый тонкий из препаратов, так как он быстрее пропитывается и сушится.

Окраска по этому методу тканевых и опухолевых клеток и лейкоцитов почти не отличается от окраски их в препаратах, обрабатываемых обычными цитологическими методами. При этом четко выделяется структура ядер, хорошо видны нуклеолы, зернистость и включения протоплазмы. Эритроциты частично гемолизируются, что облегчает исследование.

2. Приготовляют 0,4% раствор сухой краски Лейшмана в метаноле (метиловый спирт). Для ускорения растворения краски ее можно в закрытом флаконе поместить в водяную баню при 60° на 1 час, помешивая. При охлаждении краску следует профильтровать. Раствор стоек. Препараты укладывают на полочку для окраски, покрывают нетолстым слоем раствора краски Лейшмана (12 – 15 капель на каждый препарат) и оставляют их на 20 – 30 секунд. Затем, не сливая краски Лейшмана со стекла, добавляют к ней раствор краски Романовского–Гимзына нейтральной дистиллированной воде (1,6 капли на 1 мл воды), нагретый до 50 – 60°, в количестве, способном удержаться на стекле. Первый препарат смывают через 2 – 3 минуты, остальные – докрашивают. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом. Микроскопическая картина при этом способе окраски более яркая, чем при первом. Эритроциты сохраняются. Особенно четко выступают темные нуклеолы на нежно окрашенных ядрах. Дистиллированная вода для разведения краски и смывания ее с препаратов должна иметь рН 6,8 – 7,0.

Окраски по Папаниколау. Метод окрашивания по Папаниколау являетсянаилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых клетках до розового в клетках со зрелой цитоплазмой и оранжевого в клетках с ороговением), благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная мембрана и структура хроматина. Ответ дается через 15– 20 минут.

1. Смесь Никифорова.

2. Спирт 95, 90, 80, 70 и 50°.

3. Гематоксилин Гарриса.

4. 0,25%-ный раствор соляной кислоты.

5. Краска оранжевая Г.

7. Абсолютный спирт.

9. Канадский бальзам.

Приготовление гематоксилина Гарриса:

1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квацов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.

Приготовление раствора краски оранжевая Г:

К 100 мл 0,5%-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовление составной краски (ЕА-36):

45 мл 0,5%-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5%-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо- и спирторастворимого), 0,2 г фосфорновольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного раствора углекислого лития.

Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80, 70 и 50° спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса, осторожно споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25%-ный раствор соляной кислоты. Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95° спирты. Обезвоженные таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г, споласкивают в двух сменах 95° спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской (ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95° спирта. Далее препараты просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и ксилола в равных объемах и, наконец, через ксилол, после чего заключают в канадский бальзам.

К полихромным методам окраски так же относят метод Шорра (или его модификациюМ. Г. Арсеньевой (1963) и др.), позволяющий дифференцировать клетки на эозинофильные (красные) и базофильные (синие), и монохромные методы (окраска гематоксилином и эозином или гематоксилином и фуксином).Фиксация препарата производилась в метиловом спирте (15 минут). Окрашивание препаратов производилось гематоксилином-эозином. Фиксированные мазки окрашивались водным раствором гематоксилина до получения бледно-фиолетового окрашивания (7 – 10 минут). После промывания проточной водой мазки вновь окрашивались 1%-ным водным раствором эозина в течение 0,5 мин, промывались проточной водой и высушивались.При полихромном методе поверхностные клетки окрашиваются в красный или сине-зеленый цвет, промежуточные и парабазальные – в сине-зеленый, базальные – в темно-синий.

Цитохимические методы основаны на специфической химической цветной реакции между химическим реактивом и определённым компонентом клетки для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ).

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски (средний цитохимический коэффициент – СЦК).

В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы.Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 – специфическая окраска была слабой (+) и в 5 – более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60х0)+(35х1)+(5х2)/100=0+35+10/100=0,45 ед.

ШИК-реакция или PAS-реакция (для выявления гликогена).

Реактив – Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК – шифф-йодная кислота). Под влиянием периодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.

В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.

Обнаружение гликогена методом Мак-Мануса.

Метод Мак-Мануса выявляет вещества углеводной природы (гликозаминогликанов, гликопротеидов, гликогена и др.) в цитологических препаратах. Метод основывается на образовании диальдегидов, которые определяют с помощью реактива Шиффа под воздействием окислителя (йодной кислотой). В клеткахгликоген обнаруживается в виде вишнево-красных гранул.

Методы выявление ферментов:

1. Оксидазы – ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным кислородом. Среди них особое значение имеет миелопероксидаза (МП).

Миелопероксидаза –является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций. Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов.

Читайте также:  Как простимулировать овуляцию в домашних условиях

2. Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко распространены в клетках человека и животных. Они участвуют в обменных процессах с жирами, полисахаридами и нуклеопротеидами. К ним относятся такие ферменты как кислая фосфатаза и щелочная фосфатазы.

Кислая фосфатаза (КФ) – катализирует освобождение фосфата из спиртовых или фенольных моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков красного цвета в местах гидролиза субстрата. В качестве субстрата могут быть использованы нафтол-AS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др. Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и костного мозга. В гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых клеток этих рядов, где ее активность наиболее высокая.

Щелочная фосфатаза (ЩФ) –это фермент, которыйспособен освобождать фосфат, катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в щелочной среде и принимает участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот. Содержится исключительно в зрелых нейтрофилах. В периферической крови активность щелочной фосфатазы значительно выше, чем в клетках костного мозга. Фермент выявляется в виде желто-коричневых гранул в цитоплазме.

3.Неспецифическиеэстеразы (НЭ) также относятся к гидролазам. Эти ферменты способны гидролизовать простые эфиры N-свободных спиртов жирных кислот. Это весьма неоднородная группа энзимов, названия которых обусловлены субстратом, который они гидролизуют. Получено более 9 изоферментов НЭ. Фракции 1, 2, 7, 8, 9 выявляются при использовании нафтол-АБ-О-хлорацетата и представляют активность хлорацетатэстеразы, которая присутствует в гранулоцитах. Фракции 3, 4, 5, 6 взаимодействуют с эфирами α-нафтилацетата и представляют собою НЭ, выявляемые в моноцитах, плазматических клетках и тромбоцитах. Наибольший интерес для гематологов представляют хлорацетатэстераза, α-нафтилацетатэстераза, кислая α-нафтилацетатэстераза. Неспецифическиеэстеразы являются лизосомальными ферментами.

α-Нафтилацетатэстераза(αНАЭ) обнаруживается во всех миелоидных клетках, но наибольшая ее активность определяется в моноцитах. В клетках эритроидного ряда в норме она не определяется.

Кислаянафтилацетатэстераза– это фермент, локализующийся в лизосомальных гранулах. Его активность выявляется в реакции с α-нафтилацетатом в кислой среде при рН 5,8. Она характерна для Т-хелперов. Кроме того, она выявляется в клетках моноцитарного ряда.

Хлорацетатэстеразу (ХАЭ) называют гранулоцитарной. Как и миелопероксидаза, она является маркером нейтрофилов. Активность фермента выявляется в виде гранул синего цвета.

Сдвоенную реакцию на ХАЭ и αНАЭ проводят последовательно на одном мазке. Это позволяет разделить клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий, что имеет значение при диагностике миеломоноцитарного лейкоза.

Реакция Браше.Метод служит для выявления РНК. Используется реактив из смеси двух красителей:метилового зелёного и пиронина.Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет.Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.Другие структуры ядра (помимо ядрышек) – зелёные.

Реакция Фёльгена.Основной реактив – фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет.

Цитохимическое исследование липидов.Липиды локализуются в цитоплазме клеток главным образом в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черныйсудан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Красители. Классификация красителей.

2. Тинкториальные свойства клеточных структур. Метахромазия.

3. Группа основных или ядерных красителей, понятие «базофилии».

4. Кислые красители – цитоплазматические, понятие «ацидофилии».

5. Нейтральные красители. Индифферентные красители.

6. Приготовление красителей.

7. Оценка качества цитологического препарата. Артефакты.

8. Стандартная световая микроскопия фиксированных, окрашенных мазков. Разрешающая способность светового микроскопа.

9. Распространенные методы окраски цитологических препаратов.

10. Окраска гематоксилин-эозиновыми красителями. Виды гематоксилиновых красителей.

11. Окраска азур-эозиновыми красителями.

12. Техника окраски по Романовскому-Гимзе.

13. Метод Паппенгейма.

14. Окраска по Лейшману.

15. Экспресс – методы окраски цитологических препаратов: окраски по Алексееву.

16. Полихромная окраскапо Папаниколау.

17. Полихромный метод окраски поШорру.

18. Цитохимические методы исследование, цель, назначение, материалы..

20. Методы выявление ферментов, оценки их активности.

21. Методы выявления ДНК по Фельгену.

22. Метод выявления РНК по Браше.

23. Обнаружение гликогена по методу Мак Мануса.

Устанавливая рекомендуемое программное обеспечение вы соглашаетесь
с лицензионным соглашением Яндекс.Браузера и настольного ПО Яндекса .

ЗАДАЧИ И РОЛЬ КЛИНИЧЕСКОЙ ЦИТОЛОГИИ

Предмет, задачи и методы цитологии

Цитология (греч. kytos — ячейка, клетка) — наука о клетке.

Предметом ее изучения является клетка как структурная и функциональная единица жизни.

В задачи цитологии входит изучение строения и функционирования клеток, их химического состава, функций отдельных клеточных компонентов, познание процессов воспроизведения клеток, приспособления к условиям окружающей среды, исследование особенностей строения специализированных клеток, этапов становления их особых функций, развития специфических клеточных структур и др. Для решения этих задач в цитологии используются различные методы.

Основным методом изучения клеток является световая микроскопия.

Для изучения ультратонкого строения клеточных структур прибегают к методу электронной микроскопии. В электронных микроскопах вместо световых лучей используется пучок электронов.

Для исследования химического состава, выяснения локализации отдельных химических веществ в клетке широко используются методы цито- и гистохимии, основанные на избирательном воздействии реактивов и красителей на определенные химические вещества цитоплазмы.

Изучение клеток разных органов и тканей растений и животных, процессов деления клетки, их дифференцировки и специализации проводят методом клеточных культур — выращиванием клеток (и целых организмов из отдельных клеток) на питательных средах в стерильных условиях.

Методы клинической цитологии

Клиническая цитология — признанный полноценный метод морфологического анализа, основанный на изучении и оценке клеточного материала, полученного различными способами из патологического очага.

В нашей стране клиническая цитология является разделом лабораторной диагностики и это находит свое объяснение в том, что традиционно исследование клеточного состава входит в комплекс клинических лабораторных анализов — кровь, костный мозг, экссудаты, отделяемое различных органов. И если ранняя клиническая цитология была представлена преимущественно эксфолиативной цитологией: исследование жидкостей – экссудаты, промывные воды; выделений – мокрота, моча; мазков с шейки матки, с поверхности опухоли, то в настоящее время преобладает пункционная цитология. В основном материал для исследования получают посредством пункции опухолевых образований тонкой иглой, пункции под контролем ультразвука, рентгена, компьютерной томографии. Значительную долю исследований в современной клинической цитологии составляют исследования мазков и кусочков, полученных при трепанбиопсии, мазков-отпечатков с операционного и биопсийного материала, мазков щеточкой и соскобы при эндоскопических исследованиях.

В последние годы диагностическая цитология — наиболее быстро развивающийся раздел патоморфологии. Основным диагностическим направлением клинической цитологии является онкоцитология . В конечном счете цитологический анализ производится в первую очередь для того, чтобы получить ответ на вопрос о наличии злокачественного новообразования. В процессе дифференциальной диагностики определяется характер патологического процесса и устанавливаются воспалительные, реактивные, пролиферативные или предраковые поражения, а также доброкачественные опухоли.

Весь опыт существования и постоянного совершенствования клинической цитологии показывает, что цитологическое исследование позволяет с достаточно высокой достоверностью не только констатировать наличие злокачественного новообразования, но и в большинстве случаев определить гистогенез (происхождение, тканевую принадлежность) и степень дифференцировки опухоли.

Исследования, осуществляемые с помощью цитологического метода

1. Цитологическое исследование пункционного материала.

Цитологическое исследование пунктатов, полученных тонкой иглой (тонкоигольная биопсия) из опухолей, опухолеподобных образований уплотнений любой локализации: головы, шеи, молочной, щитовидной железы, лимфатических узлов, костей, мягких тканей конечностей, кожи, легких, средостения, органов брюшной полости и забрюшинного пространства,

2. Цитологическое исследование эксфолиативного материала.

Цитологическое исследование секретов, экскретов, отделяемого и соскобов с поверхности эрозий, язв, ран, свищей, мокроты, промывных вод, экссудатов, транссудатов.

3. Цитологическое исследование эндоскопического материала.

Исследование материала, полученного при бронхоскопии, катетеризации бронхов, эзофаго-, гастро-, дуодено-, лаборо-, ректоромано-, колоно-, цистоскопии и других видов эндоскопического обследования при любой локализации патологического процесса.

4. Цитологическое исследование биопсийного и операционного материала

Цитологическое исследование мазков – отпечатков, соскобов с биопсийных кусочков и операционного материала.

Цитохимическое исследование материала – в т. ч. на гликоген, липиды, ДНК, РHК, ферменты и др.

Определение полового хроматина в клетках опухоли.

Цитологическое исследование материала, полученного при профилактических осмотрах населения.

Исследования вагинального эпителия и уроцитограмм с целью определения эстрогенной насыщенности организма с подсчетом формулы созревания, КПИ, ЭИ и др.

Доставка, регистрация и маркировка материала

Материал для цитологического исследования должен быть доставлен в лабораторию в ближайшие сроки после получения. (жидкость моча, содержимое кист, промины воды экссудаты, мокрота). Мазки, высушенные на воздухе, могут храниться.

Флаконы с материалом и стекла-мазки должны быть маркированы (указана фамилия больного).

В сопровождающем материал направлении должно быть:

фамилия, имя и отчество, пол и возраст больного;

каким образом и откуда получен материал;

в каком виде направляется (жидкость, стекла-мазки), количество;

Читайте также:  Посев на аэробы

краткий анамнез с обязательным указанием на наличие и характер вредных воздействий, предшествующего лечения (в особенности гормонального, лучевого, химиотерапии);

данные других методов исследования (рентген, эндоскопия и др.), при подозрении на системное заболевание (гемобластозы) — анализ крови;

описание status localis;

Способы получения и характер материала для цитологического исследования

Материал для цитологического исследования может быть получен различными способами. Прежде всего это:

а) Эксфолиативная цитология , где анализу подвергаются:

отделяемое различных органов (молочная железа, бронхи и др.). Для приготовления препарата капля отделяемого наносится на стекло и готовится мазок. Можно также делать отпечатки с места выделения (сосок молочной железы, выходное отверстие свища). Отделяемое бронхов обычно в виде мокроты собирается в сосуд, приготовление препаратов подробно описано в разделе исследования органов дыхания, жидкости и содержимое кист получают путем пункции полостей (брюшной, плевральной и др.) и кист. Если материала мало, то он наносится на стёкла и распределяется в виде тонкого мазка. Значительные количества жидкости предварительно центрифугируются и затем мазки готовят из осадка. Таким же образом обрабатывается материал промывных вод, отпечатки со слизистых и кожных покровов, если это доступно, можно делать непосредственно на стекло. В других случаях мазки готовят из соскобов шпателем, с тампонов.

Для исследования эксфолиативного материала в гинекологии существуют отработанные методики, описание которых — в соответствующем разделе.

б) Пункционная цитология — один из наиболее частых видов исследования в клинической цитологии.

Пункция опухолевых образований производится, как правило, тонкой иглой. Для проведения аспирационной биопсии необходим определенный навык. Кроме того, для получения полноценного материала необходимо соблюдать ряд условий. В частности, игла и шприц для пункции должны быть сухими. Не следует проводить предварительную анестезию (введение новокаина). Для пункции богато васкулизированных образований (щитовидная железа, сосудистые опухоли, кость и др.), необходимо использовать иглу с мандреном, последний извлекается после введения иглы в место, из которых предполагается получить материал. Таким же образом, соблюдая вышеописанные правила и используя специальные приспособления, осуществляют пункции под контролем рентгена, ультразвука или компьютерной томографии.

в) Использование для цитологического исследования мазков-отпечатков с биопсийного и операционного материала значительно повышает эффективность цитологической диагностики. Кроме того, морфологическое заключение может быть получено значительно раньше, чем гистологическое. Следует отметить исключительную ценность таких параллельных исследований (цитологических и гистологических) в возможности проведения цитогистологических сопоставлений, что в свою очередь существенно обогащает как один, так и другой метод.

Для приготовления препарата необходимо соскоб со среза биоптата или операционного материала распределить тонким мазком на стекле. Отпечатки со среза биоптата или кусочка оперативно удаленной ткани наносятся прикосновением поверхности среза к стеклу. Если отпечатки делают с ткани богатой кровью (печень, селезенка и др.), с поверхности среза необходимо снять кровь на фильтровальную бумагу и лишь затем производить отпечатки на стекло.

г) С развитием эндоскопической техники обязательное цитологическое исследование стало более доступным. В современных эндоскопических приборах имеются специальные приспособления для взятия материала на морфологическое исследование. При эндоскопии могут быть получены в частности:

мазки – отпечатки щипковых биопсий.

Выбор способа взятия материала определяется характером поражения, локализацией, возможностью проведения инструментальных исследований. Желательно использование в комплексе всех доступных методов взятия материала. В частности, при поражениях мочевого пузыря для цитологического исследования может быть использована нативная моча (эффективность цитологической диагностики 40-50%), спиртовой смыв (эффективность цитологической диагностики 60-65%), мазки-отпечатки с кусочков опухоли, взятых при цистоскопии (эффективность цитологической диагностики около 90%). При комплексном обследовании эффективность цитологической диагностики составляет около 100% .

Цитологическое исследование является обязательным компонентом различных клинических методов обследования и необходимо при гинекологическом осмотре брать мазки с шейки матки и из цервикального канала, при подозрении на патологию тела матки-мазки аспирата.

а) бронхоскопия — мазки щеточкой, трансбронхиальные пунктаты, мазки из материала щипковых биопсий, промывные воды,

б) гастроскопия — мазки щеточкой, отпечатки с щипковых биопсий,

в) колоноскопия, ректоскопия — мазки с ватного тампона, щеточные мазки, отпечатки с биопсий,

г) цистоскопия — нативная моча, спиртовый смыв, отпечатки, с биопсийных кусочков.

д) ларингоскопия — мазки с участков поражения и отпечатки с кусочков,

е) кожа и слизистые оболочки — мазки соскобов с участков поражения, при опухоли — пункция тонкой иглой (мягкие ткани, молочная железа, лимфатические узлы, щитовидная железа) — пункция тонкой иглой.

Пункция под контролем ультразвука (щитовидная железа, опухоли шеи, печень, селезенка, почка, матки, яичники, предстательная железа, забрюшинные опухоли).

Цитологическому исследованию обязательно должны подвергаться пунктаты серозных полостей, кист, отделяемое из соскоба молочной железы и др.

Стекла для препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.

1. Стекла тщательно промывают щеткой в теплой мыльной (или с моющим средством) воде.

2. Основательно промывают в проточной теплой воде.

3. Затем кипятят 1—2 часа в воде с добавлением соды (2—3%) или моющего средства.

4. После хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают в проточной (1—2 часа).

Обработанные и промытые в воде стекла протирают мягкой тряпкой, держа стекла за края и хранят в смеси Никифорова (равные части 96° спирта и эфира). По мере надобности пинцетом извлекают стекла из смеси Никифорова и протирают сухой тряпкой. Обработанные таким образом стекла могут быть использованы для приготовления цитологических препаратов.

Для проведения цитохимических исследований очень хорошие результаты дает обработка предметных стекол и других стеклянных предметов в хромовой смеси следующего состава:

Двухромовокислый калий (бихромат калия) — 100 г

Вода горячая — 1000 мл

Неочищенная серная кислота — 100 мл

Для приготовления этой смеси растворяют в горячей воде двухромовокислый калий, затем охлаждают раствор и после этого добавляют серную кислоту. Кислоту льют осторожно (обязательно в вытяжном шкафу), при этом смесь весьма сильно нагревается и приобретает темно-коричневый цвет. В этом составе предметные стекла и другую стеклянную посуду выдерживают 2—3 дня, а после промывают в проточной воде в течение 1—2 дней.

На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться тонким слоем, а не собираться в капли.

Для обеспечения надежной маркировки стекол используют механический и химический способы «матирования» края поверхности стекла. Механический способ основан на обработке предметного стекла абразивным камнем на станке. При использовании второго способа в пластмассовый сосуд вместимостью около 300 мл помещают 50 г фторида аммония и 50 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь тщательно перемешивают до кашицеобразной консистенции (в вытяжном шкафу). Высота слоя смеси в сосуде не должна превышать 1,5 см. Чистые предметные стекла устанавливают вдоль стенок сосуда таким образом, чтобы один конец стекла был погружен в смесь. В сосуде последовательно размещают 20 — 25 предметных стекол. Через 1 мин стекла переносят на 10—15 мин в пластмассовое ведро с большим количеством воды. Затем воду сливают и стекла обрабатывают слабым раствором серной кислоты (5 мл концентрированной кислоты на 8—10 л воды) для их обезжиривания. После этого стекла тщательно промывают водой и просушивают (можно с помощью вентилятора). Всю работу по подготовке предметных стёкол выполняют в резиновых перчатках. Смесь фторида аммония и концентрированной соляной кислоты можно использовать многократно, добавляя небольшое количество кислоты. Маркировать стекла можно также, подписывая один край стекла тушью.

Если это специально не оговорено методикой, то, как правило, фиксируют высушенные мазки. Лучшим фиксатором для цитологических препаратов является метанол. В метаноле фиксацию проводят от трех до десяти минут.

Кроме того, для фиксации может быть использован этиловый спирт 100°. Время фиксации составляет 10—30 минут.

В качестве фиксатора может использоваться смесь Никифорова (время фиксации минимум 15 минут, максимум 1—2 часа). Некоторые красители (Лейшман, Май-Грюнвальд) являются одновременно фиксаторами.

Для приготовления абсолютного спирта в лабораторных условиях используются прокаленный (безводный) медный купорос.

Приготовление безводного купороса. Берут химически чистый синий купорос (если он крупнокристаллический, то его предварительно толкут в фарфоровой ступке) и прокаливают в фарфоровой чашке. В результате прокаливания происходит удаление кристаллизационной воды из молекулы медного купороса (CuSO4*5H2O) и получается безводный купорос белого цвета (CuSO4). При соприкосновении с водой такой безводный купорос вновь жадно поглощает воду и дает первоначальное соединение синего цвета, на чем и основано его применение для обезвоживания спирта.

Прокаливание ведут с соблюдением известных предосторожностей, а именно: мелко размельченный купорос небольшими порциями прокаливают на малом огне через асбестовую сетку в фарфоровой чашке (или медной посуде) при постоянном помешивании фарфоровой или стеклянной лопаткой. Нельзя пользоваться металлическим шпателем и вести прокаливание в железной или никелированной посуде. Несоблюдение указанных правил может повести к пережиганию, точнее, к разложению медного купороса с образованием окислов меди (CuO). Последнее обстоятельство весьма неблагоприятно сказывается на способности купороса поглощать воду.

Читайте также:  Лапароскопия удаление матки

Хорошо и осторожно прокаленный медный купорос должен быть совершенно белым или слегка голубоватым: при перекаливании он приобретает серый цвет. Пережженный купорос при соединении с водой дает грязно-зеленые тона, что является нежелательным, ибо затрудняет контроль за ходом обезвоживания спирта. Очень хорошо вести прокаливание купороса на электрической плитке малой мощности или даже в термостате при температуре 60—70°; в этом последнем случае мелко растолченный купорос рассыпают тонким слоем на картоне. Прокаливание в термостате при 60—70° идет медленно, около 3 недель (при ежедневном перемешивании), а при температуре 100° — в течение 1—2 дней (в фарфоровой чашке).

При прокаливании медный купорос начинает отдавать кристаллизационную воду уже при температуре 60°, а при 100° частично разлагается и становится серым. Прокаленный купорос хранят в банке с притертой пробкой.

Приготовление абсолютного спирта . Для приготовления абсолютного спирта прокаленный белый купорос насыпают в большую широкогорлую банку и заливают 90° спиртом из такого расчета, чтобы столб спирта над купоросом превышал толщину слоя последнего не больше чем в 4—5 раз. Содержимое банки ежедневно взбалтывают в течение 4—5 дней, добиваясь посинения всей толщи оседающего купороса. После этого в банку подсыпают еще порцию белого купороса, но уже в меньшем количестве, примерно в 2—3 раза, и оставляют на 1—2 дня. Подсыпание купороса повторяют до тех пор, пока последняя порция его не перестанет синеть, тогда абсолютный спирт считается готовым. Такой абсолютный спирт хранится постоянно на медном купоросе и используется по мере надобности для различных целей.

Если обезвоживанию подвергается 95—96° спирт, то (прокаленный) купорос приходится добавлять не больше 1—2 раз, и выход абсолютного спирта в этом случае будет составлять около 60—70%. Относительно небольшой выход абсолютного спирта объясняется тем, что значительная часть его остается на купоросе

Техника приготовления мазков

Полученное количество материала не всегда определяет возможности диагностики, иногда очень малое количество материала является достаточным для постановки диагноза. Наличие большого количества крови часто является помехой. При её наличии мазки необходимо делать как можно скорее, иначе наступает свертывание и из свернувшегося сгустка очень трудно сделать мазки и провести исследование. Материал наносят на стекло и очень аккуратно делают мазки, т. к. клетки очень ранимы, а наличие большого количества разрушенных клеток мешает правильной диагностике.

Из жидких пунктатов мазки готовят подобно мазкам крови, если полученная масса плотная или комковатая, то помимо мазков можно приготовить и отпечатки на стекле.

Метод отпечатков имеет определенные преимущества:

Во-первых клетки подвергаются гораздо меньшему травматизму.

Во-вторых есть возможность расположения клеток пластами, что помогает при описании цитологического препарата характеризовать и соотношение клеток между собой.

В-третьих, если материал богат кровью, его необходимо нанести на стекло и тогда выбирать оттуда "белые крупинки" и ими делать мазки.

Метод отпечатков применим при использовании цитологического метода во время операционного вмешательства, а так же получении биопсии. Этот метод может быть использован как самостоятельно, так и параллельно с гистологическим анализом.

В этих случаях помимо пункций проводят получение отпечатков с удаленных или обнаженных органов, с помощью прикосновения стекла предметного к исследуемой ткани. Так же можно готовить препараты при получении материала методом соскоба.

Жидкости, полученные при пункции, тут же центрифугируют, далее сливают верхний слой из центрифуги, а из осадка делают мазки, которые и подвергают цитологическому исследованию. В некоторых случаях приготовленные препараты можно просмотреть под микроскопом, однако диагностику патологии необходимо проводить только по окрашенному препарату.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКОВ

Методы подсчета лейкоцитарной формулы

Лейкоцитарная формула – это процентное соотношение различных видов лейкоцитов. Подсчитывается при микроскопии окрашенных мазков крови или в гематологических анализаторах.

Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.

Подготовка стекол. Стекла (новые и бывшие в употреблении) замачивают на 8-10 часов в 2% растворе хозяйственного мыла или СМС в эмалированной посуде, кипятят в этом же растворе 5-10 минут. Более длительное кипячение и использование алюминиевой посуды не рекомендуется, так как приводит к помутнению стекол. Промывают стекла в проточной воде, насухо вытирают и помещают для обезжиривания на 30-60 минут в смесь Никифорова (спирт 96% и диэтиловый эфир в соотношении 1:1). Насухо вытирают чистой тканью и хранят в закрытой чистой посуде.

Приготовление мазков. Мазок крови делается с помощью шлифованного стекла с идеально ровным краем, ширина которого должна быть на 2-3мм меньше, чем у предметного стекла. После прокола пальца первую каплю удаляют сухим ватным тампоном. К куполу следующей капли прикасаются предметным стеклом на расстоянии 1,5-2см от края стекла. К коже в месте прокола не прикасаться! Капля крови на предметном стекле должна иметь диаметр 2-3мм. Шлифованное стекло ставят под углом 45º на 1-2мм перед каплей и двигают его назад к капле так, чтобы вся кровь растеклась по краю шлифованного стекла. Быстрым легким движением делают мазок, пока не кончится вся капля крови. Высушивают мазки на воздухе. Маркируют их простым карандашом, обозначая на толстой части мазка фамилию и инициалы пациента или его регистрационный номер. Делают не менее двух мазков.

Требования к мазку. Правильно приготовленный мазок должен быть:

– равномерной толщины, полупрозрачным, желтоватого цвета;

– достаточной величины – занимать ½ – ¾ длины предметного стекла, отступив от края на 1-1,5см;

Толстые мазки для исследования не пригодны, так как клетки в них располагаются в несколько слоев и деформируются. В правильно приготовленных тонких мазках клетки располагаются в один слой.

Готовые высушенные мазки крови фиксируют, а затем окрашивают. В неокрашенном виде мазки сохраняются при комнатной температуре в течение 3 дней.

Фиксация мазков предохраняет элементы крови от воздействия содержащейся в красках воды, под влиянием которой в нефиксированных мазках происходит разрушение эритроцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксация также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле. Фиксацию проводят либо в специальной кювете, либо в широкогорлой банке с хорошо закрывающейся крышкой.

Для фиксации используют следующие реактивы:

– метиловый спирт – время фиксации 3-5 минут;

– раствор эозинметиленового синего по Май-Грюнвальду (фиксация 3 минуты);

– этиловый спирт (фиксация 20-25 минут);

– смесь Никифорова (фиксация 30 минут).

Фиксированные мазки высушивают на воздухе и окрашивают.

Окраска мазков. Проводится в специальных кюветах или на «мостике». В качестве унифицированных приняты 3 метода окраски мазков крови:

Принцип окраски мазков крови.Основу современных методов окраски клеток крови заложил русский врач Д.Л. Романовский, который в конце 19 века предложил окрашивать препараты одновременно двумя красителями – щелочной и кислой реакции. Различные клеточные структуры имеют разную рН и связываются с красителем противоположной реакции. Ядра клеток богаты нуклеиновыми кислотами, имеют кислую реакцию и окрашиваются красителями щелочной реакции (метиленовым синим, азуром I и II) в сине-фиолетовый цвет. Цитоплазма гранулоцитов, зернистость эозинофилов, эритроциты содержат щелочные белки, поэтому окрашиваются красителем кислой реакции (эозином) в розовый цвет.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Реактив: готовая краска Романовского. В её состав входит азур-II (смесь равных частей азура-I и метиленового синего) и эозин. Заводская краска очень концентрированная и перед употреблением её нужно разводить. Степень разведения и время окраски определяется опытным путем и называется титрование краски Романовского.

Титрование краски Романовского. Готовят три разведения краски из расчета: 1, 2 и 3 капли красителя на 1мл дистиллированной воды. Каждым из разведений окрашивают 5 зафиксированных мазков в течение 20, 25, 30, 35 и 40 минут. На каждом мазке отмечают время окраски и разведение красителя. После окрашивания микроскопируют мазки и определяют разведение и время, при которых получена наилучшая окраска. Эти условия, соответствующие лучшему окрашиванию, указывают на этикетке бутыли с краской. Например: титр краски – 1капля/мл; экспозиция – 30 минут. Титрование краски Романовского проводят один раз перед использованием каждой новой партии красителя.

Ход окраски.В специальную кювету для окрашивания наливают раствор краски Романовского, приготовленный непосредственно перед использованием в соответствии с установленным титром. В рабочий раствор красителя опускают штатив с сухими фиксированными мазками. Красят мазки в соответствии с выбранной экспозицией. Промывают мазки проточной водой и высушивают на воздухе.

Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 9094 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock detector