Окраска толстой капли

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные стекла простые и шлифованные.
  2. Покровные стекла.
  3. Лоток эмалированный с мостиком для препаратов.
  4. Промывалка.
  5. Мерные цилиндры емкостью 100 мл.
  6. Пинцеты Корне.
  7. Песочные часы.
  8. Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл.
  9. Краска Романовского.
  10. Азур.
  11. Эозин.
  12. Краска Май-Грюнвальда.
  13. Краска Лейшмана.
  14. Метиловый спирт.
  15. Этиловый 96° спирт.
  16. Эфир.
  17. Двууглекислый натрий.
  18. Ледяная уксусная кислота.
  19. Дистиллированная вода.

Подготовка предметных стекол для приготовления мазков крови и толстой капли

Качество препаратов крови зависит от чистоты предметных стекол, поэтому новые и бывшие в употреблении стекла подвергают специальной обработке. Для этого с них предварительно удаляют иммерсионное масло кусочком ватки, смоченной бензином или эфиром и помещают на 30 минут в кастрюлю с кипящим мыльным раствором. Многократно промывают водопроводной и дистиллированной водой и помещают в смесь, состоящую из равных частей 96° спирта и эфира. Подготовленные предметные стекла извлекают из смеси с помощью пинцета, вытирают тряпочкой без ворса и, не прикасаясь к ним руками, во избежание загрязнения их поверхности, складывают в коробки, чтобы предохранить от пыли.

Мазки крови приготовляют на чистых предметных стеклах, пользуясь шлифованными предметными или покровными стеклами, чтобы край этих стекол был уже поверхности предметного стекла, на котором готовят мазки, углы стекол иногда надламывают или надпиливают.

Приготовление мазков крови

Прием 1. Предметное стекло захватывают за длинные ребра большим и указательным пальцами правой руки и прикасаются противоположным концом стекла к свежевыступившей капле крови на расстоянии 1-1,5 см от края стекла.

Прием 2. (рис. 29, 1). Предметное стекло располагают между большим пальцем левой руки с одной стороны и указательным и средним – с другой так, чтобы капля крови оказалась сверху и справа.

Прием 3 (рис. 29, 2). Шлифованное предметное или покровное стекло располагают слева и от капли под углом в 45°, при этом его держат большим и указательным пальцами правой руки так, чтобы кончики пальцев касались его длинных ребер.

Прием 4 (рис. 29, 3). Шлифованное предметное или покровное стекло продвигают вправо до соприкосновения с каплей крови и тем самым способствуют распределению крови между стеклами. Когда вся кровь распределится между стеклами (рис. 29, 4), достаточно быстро, спокойно и не надавливая продвигают стекло влево до тех пор, пока капля крови не будет исчерпана (рис. 29, 5, 6). Правильно сделанный мазок равномерной толщины, желтоватого цвета, просвечивает и на конце заканчивается щеточкой; он занимает не более 3/4 и не менее 1/2 длины предметного стекла. Это достигается распределением капли крови, размер которой в диаметре 2-3 мм.

Приготовленный мазок подсушивают на воздухе, после чего на его поверхности углом предметного стекла или грифельным карандашом надписывают фамилию больного. Из крови каждого больного готовят не менее двух мазков.

Приготовление толстой капли

К свежевыступившей капле крови прикасаются предметным стеклом три раза подряд, причем так, чтобы каждая капля отстояла на некотором расстоянии от другой. Углом чистого предметного стекла расширяют капли. Затем препарат подсушивают на воздухе в течение 1-2 часов и маркируют его карандашом по стеклу или специальными чернилами.

Читайте также:  Лысяков сергей николаевич

Окраска и фиксация мазков крови

До окраски мазки крови необходимо зафиксировать: 1) метиловым алкоголем в течение 3 минут, 2) абсолютным этиловым спиртом – 5 минут, 3) чистым ацетоном – 5 минут, 4) смесью Никифорова (равные объемы 96° этилового сппрта и эфира) – 10-15 минут или 5) фиксатором Май-Грюнвальда в течение 3 минут.

Фиксацию препаратов крови производят следующим образом. В широкогорлую банку с притертой пробкой, в которую налит один из фиксаторов, устанавливают предметные стекла, сложенные попарно мазками наружу (рис. 30). При большом количестве мазков крови каждую пару предметных стекол захватывают кусочками разрезанной по длиннику полой резиновой трубки, что предотвращает соприкосновение мазков друг с другом. По истечении времени фиксации предметные стекла захватывают пинцетом Корне, располагают на мостике мазками кверху на небольшом расстоянии друг от друга. Мостик монтируют из двух одинакового диаметра и длины трубок или пипеток, которые соединяют между собой резиновой трубкой (расстояние между параллельно расположенными стеклянными трубками должно быть 5-6 см).

Для окрашивания фиксированных препаратов крови применяется краска Романовского, которая готовится следующим образом: 3,8 г сухой краски растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Оставляют на несколько дней и периодически взбалтывают, после чего прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3-5 дней при частом взбалтывании. В работе применяют краску Романовского, имеющуюся в продаже, которую разводят на дистиллированной нейтральной воде. Так как дистиллированная вода не всегда бывает нейтральной, ее реакцию проверяют с помощью индикаторной бумаги.

Для получения лучшей окраски пользуются буферными растворами.

Для нейтрализации воду щелочной реакции подкисляют 1% раствором уксусной кислоты. Дистиллированную воду кислой реакции нейтрализуют 1% раствором двууглекислого натрия. Результаты нейтрализации устанавливают с помощью индикаторной бумаги.

Титр краски Романовского (количество капель основного раствора краски на 1 мл дистиллированной воды) устанавливают путем окрашивания мазков крови разными разведениями краски: 1, 2 или 3 капли на 1 мл нейтральной дистиллированной воды. Для окраски одного мазка требуется 3-4 мл разведенной краски Романовского. Разведение краски производят в цилиндрах, причем краску приливают к воде и размешивают, но не наоборот. По мазку с лучшей окраской устанавливают титр краски и время окрашивания; этим титром пользуются для окрашивания препаратов крови.

Окраска мазков крови по Романовскому

Высушенные на воздухе и надписанные мазки фиксируют одним из указанных выше фиксаторов, кладут на мостики и после высыхания фиксатора покрывают на 20-25 минут разведенной по титру краской Романовского. Краску сливают, а мазки смывают водой и высушивают.

Окраска мазков крови по Нохту

Для окраски препаратов по этому методу готовят краску азур-эозин: 1 г сухой краски азур II растворяют в 1 л дистиллированной воды и 1 г водного эозина растворяют в 1 л дистиллированной воды. Растворы хранят отдельно в темном месте.

Для окраски используют смесь, состоящую из 0,5 мл раствора азура, 0,5 мл раствора эозина и 3 мл дистиллированной воды.

На фиксированный и высушенный мазок крови наливают на 20-30 минут азур-эозин, затем краску смывают: водой и высушивают мазки.

Окраска мазков крови по Лейшману

Для окраски препаратов необходима краска Лейшмана, которая продается в готовом виде, и дистиллированная вода нейтральной реакции.

На нефиксированный мазок наливают 15-20 капель, краски Лейшмана (благодаря наличию спирта в краске; происходит одновременная фиксация препарата) на 2 минуты. Пипеткой прибавляют 30-40 капель дистиллированной воды нейтральной реакции, производят смешение реактива с водой, красят 4-5 минут. Мазок промывают водой и высушивают на воздухе.

Читайте также:  Гистология после гистероскопии

Окраска мазков крови по Крюкову-Папенгейму

Для окраски препаратов надо иметь: 1) фиксатор Май-Грюнвальда, 2) дистиллированную воду нейтральной реакции и 3) разведенную по титру краску Романовского. Для приготовления фиксатора Май-Грюнвальда 0,5 г краски (эозиновокислой метиленовой синьки) растворяют в 200 мл метилового спирта; фиксатор имеется также в готовом виде.

На нефиксированный мазок на 3 минуты наливают 10-15 капель фиксатора Май-Грюнвальда. Не сливая фиксатор, на мазок наливают 10-15 капель дистиллированной воды нейтральной реакции и выдерживают одну минуту, затем фиксатор с водой сливают и на препарат наливают разведенную по титру краску Романовского. Через 15-20 минут препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окраска толстой капли крови

Толстые капли крови не фиксируют. Предметные стекла с хорошо просушенными толстыми каплями располагают па мостике на некотором расстоянии одно от другого и на 8-10 минут наливают на них краску Романовского (того же разведения, что и для окраски мазков крови). Происходит выщелачивание эритроцитов. Затем краску сливают и на препараты наливают новую порцию разведенной краски Романовского на 20-30 минут. Затем осторожно, чтобы не смыть, капли, предметные стекла ополаскивают водой и высушивают.

Использование большего­ объема крови с целью улучшения условий обнаружения в крови малярийных плазмодий, спирохет возвратного тифа, эозинофилов и полихроматофилов.

Посуда и аппаратура.

  • 1. Предметные стекла.
  • 2. Мостик для окраски с кюветой.
  • 3. Штатив для сушки мазков.
  • 1. Краска Романовского.
  • 2. Дистиллированная вода.

Приготовляют обычный мазок крови и на толстые места его наносят отдельно две большие капли крови. Каждую каплю концом иглы или углом другого стекла размазывают до величины двух- или трехкопеечной монеты и сушат на воздухе.

Мазок до нанесения толстых капель и после не фиксируют, а наливают на него на несколько минут дистиллированную воду для извлечения гемоглобина. Окрашенную гемоглобином воду затем осторожно сливают и на препарат наливают разведенную, как обычно, краску Романовского на 20–30 мин. После окраски препарат осторожно промывают водой, чтобы не смыть каплю, и высушивают на воздухе.

Больший объем крови, чем в мазках, и гемолиз эритроцитов позволяют легче обнаружить в крови малярийные плазмодии, спирохеты возвратного тифа, а также эозинофилы и полихроматофилы.

При хорошей фиксации и окраске любым из приведенных выше способов ядра лейкоцитов окрашиваются в вишнево-красный цвет с хорошо видимой структурой хроматина,

ядрышки — в синевато-голубоватый или в светло-фиолетовый,

цитоплазма нейтрофилов — в светло-розовый,

лимфоцитов — в чистый сине-голубой,

моноцитов — в серо-голубой или дымчатый,

зернистость нейтрофильная — в красновато-фиолетовый,

эозинофильная — в оранжево-красный,

базофильная — в темно-фиолетовый или темно-серый,

азурофильная — в вишнево-красный,

эритроциты — в бледно-розовый цвет.

Приведенные методы окраски дают возможность дифференцировать вид клеток, особенности структуры их ядер и цитоплазмы и патологические изменения в них.

Диагностика малярии основана на данных клинических проявлений, эпидемиологического расследования и лабораторных методах исследования, включающих методики выявления паразитов, их количества, видовую принадлежность и обнаружение антител в организме исследуемого. Обследованию в первую очередь подлежат пациенты из группы риска — прибывшие из эндемичных по малярии регионов, лихорадка у которых появилась в первые два года после выезда из этих регионов.

Рис. 1. Забор крови для приготовления препарата «толстая капля».

Рис. 2. Окраска и вид препаратов «толстая капля» и тонкий мазок.

Диагностика малярии с использованием микроскопического метода

Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка, позволяющая обнаружить паразитов, их количество и видовую принадлежность, является ведущим методом диагностики малярии. Она проводится при малейшем подозрении на это заболевание, независимо от температурной реакции пациента. Для определения видовой принадлежности паразитов и стадии заболевания используется тонкий мазок крови. В толстой капле локализуется больше паразитов, чем в мазке. Этот метод диагностики превосходит методику определения наличия возбудителей малярии в тонком мазке крови в 20 — 40 раз.

Читайте также:  Как задержать месячные на день

В периферической крови паразиты обнаруживаются через определенное время после заражения:

  • при 3-х дневной малярии — через 8 — 12 дней,
  • при тропической — от пяти с половиной дней до 12,
  • при 4-х дневной — через 15 — 21 день,
  • при малярии, подобной 3-х дневной — через 9 — 15 дней.

Паразиты в крови присутствуют как во время лихорадочного приступа, так и в межприступный период и при паразитоносительстве.

Рис. 3. Техника приготовления тонкого мазка.

Техника приготовления «толстой» капли

Полученная при проколе пальца капля крови наносится на предварительно очищенное и сухое предметное стекло и размазывается до получения пятна 1 см в диаметре. После подсушивания на воздухе предметное стекло заливается краской Романовского—Гимзы. По истечении 40-минутной экспозиции препарат ополаскивается под проточной водой и подсушивается при комнатной температуре, установленный в вертикальное положение.

Под микроскопом исследуется не менее 100 полей зрения. Более эффективным считается исследование 2-х толстых капель в течение 2,5 минут, чем 1-й капли в течение 5-и минут. 100 полей зрения просматриваются даже в том случае, когда малярийные плазмодии выявились уже в первых полях. Это производится для того, чтобы не пропустить микст-инфекцию.

Рис. 4. Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка является ведущим методом диагностики малярии.

Порог обнаружения паразитов

Порогом обнаружения малярийных плазмодиев называется минимальная концентрация возбудителей, которую возможно выявить при микроскопировании препарата «толстая капля». При заболевании этот показатель составляет 5 паразитов в одном микролитре крови. При просмотре 100 полей зрения обследуется 0,2 мкл крови.

При наличии косвенных признаков малярии (пребывание в эндемичных зонах, гипохромная анемия, обнаружение пигмента в моноцитах) и отрицательных результатов исследования препаратов «толстая капля», исследование вновь повторяется более тщательно, и не одно, а серия, состоящая из 4 — 6 препаратов при одном уколе, либо полученных при заборе крови, который производится 4 — 6 раз в сутки в течение 2 — 3 дней.

Интенсивность паразитемии определяется знаком «+».

  • 1 (+) обозначает выявление от 1 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 5 — 50 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 2 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 50 — 500 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 3 (+) обозначает выявление от 1 до 10 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 500 — 5000 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 4 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 5000 — 50000 плазмодиям в одном мкл крови;
  • 5 (+) обозначает выявление более 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует более 50000 плазмодиям в одном мкл крови.

Интенсивность паразитемии можно вычислить по количеству паразитов на 100 эритроцитов в 10 полях зрения, либо по соотношению числа паразитов и лейкоцитов в 1 мкл крови.

По интенсивности паразитемии определяется прогноз при тропической малярии. При других видах заболевания более 2% эритроцитов не поражается.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock detector