Пцр количественный вич

Содержание

Способ лечения болезни, вызванной вирусом иммунодефицита человека, не найден до сих пор. Зато диагностика достигла серьезных успехов. Анализ на ВИЧ, выполненный методом ПЦР, – один из вариантов выявления вируса в организме.

Суть методики ПЦР при ВИЧ

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, – один из современных методов диагностики ВИЧ. В его основе лежит способность нуклеиновых кислот к саморепродукции. Клетка любого живого организма включает белок и нуклеиновые кислоты:

  • РНК- рибонуклеиновую,
  • ДНК- дезоксирибонуклеиновую.

Эти макромолекулы хранят генетический код. Если концентрация вирусных клеток в крови низкая, в пробе содержатся не целые цепочки ДНК, а их отдельные «кирпичики» – нуклеотиды. Полимеразная цепная реакция выявляет даже такие «обломки» вирусных клеток. Этот анализ крови на ВИЧ позволяет получить результат на ранних сроках после возможного заражения, когда клинические первые симптомы еще не появились.

Наиболее точный результат можно получить, используя для анализа венозную кровь. Перед тем как пройти обследование, за пару дней следует отказаться от жирной пищи и алкоголя. За 2 недели прекратить прием иммуностимулирующих препаратов.

Пробу биоматериала расщепляют в медицинском лабораторном реакторе. Затем фракции обрабатывают ферментами. Реактивы объединяются с ДНК вирусной молекулы и дублируют ее. Из одной клетки получается 2, из 2-х – 4, далее 8. Число растет в геометрической прогрессии. Цепная реакция позволяет в короткий срок увеличить количество вирусного компонента и сделать его заметным для лаборантов.

Нормой является отрицательный результат анализа, который выглядит так: «ДНК вируса не обнаружено». Это и есть референсное (среднестатистическое) значение.

Преимущества и недостатки методики ПЦР при ВИЧ

Диагностика ВИЧ с помощью ПЦР имеет неоспоримые преимущества, но есть и существенные недостатки. К первым относятся:

  • Высокая точность. Крайне мала вероятность получить ложноотрицательные результаты.
  • Универсальность. Для исследования подходит не только кровь, но и другие биологические жидкости (влагалищные выделения, сперма). Слюна, моча также используются, но точность результата будет ниже. В этих средах концентрация вирусных клеток незначительна.
  • Широкий спектр анализа. Один образец биоматериала можно исследовать на несколько заболеваний.
  • Скорость выполнения. Полимеразная цепная реакция относится к срочным методам диагностики. Ответ можно узнать уже на следующий день.
  • Достоверность составляет 80 %. С помощью метода ПЦР можно обнаружить вирусные частицы, даже если их концентрация невелика. Это позволяет диагностировать заболевание на ранних стадиях и своевременно начинать терапию.
  • Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции. Время, когда ВИЧ обнаруживают в крови при помощи ПЦР, – 10-14 дней после предполагаемого заражения. Это стандартный отрезок для диагностики вируса иммунодефицита. Антитела на этом этапе еще не обнаруживаются; метод ИФА не работает.
  • Нет возрастных ограничений. Можно проводить это тестирование ребенку с момента рождения.

Недостатки метода ПЦР при диагностике ВИЧ:

  • Более высокая стоимость в сравнении с иммуноферментным анализом 3 поколения.
  • Требуется сложное медицинское оборудование.
  • Погрешность 20% в связи с высокой чувствительностью реакции. При аутоиммунных заболеваниях, злокачественных опухолях, хронических инфекциях ПЦР может дать ложноположительный результат.

Кому проводится ПЦР

Проведение этого анализа на ВИЧ рекомендовано в следующих случаях:

  • Нужен ранний ответ для предварительного диагностирования. ПЦР помогает подтвердить или опровергнуть результаты ИФА.
  • Иммуноблоттинг дал положительный результат. Если первым проводится ПЦР анализ, то обязательно подтверждение результата методом иммунного блоттинга. Исследования дополняют друг друга. Используя сразу 2 метода, медики исключают возможность ошибок.
  • Когда позитивный ВИЧ-статус подтвержден, ПЦР помогает отследить эффективность проводимой терапии.
  • Используется для исследования донорской крови на наличие антител к ВИЧ.
  • Проводить ПЦР можно даже детям до года. Этот метод применяется, чтобы выяснить ВИЧ-статус новорожденных, мамы которых являются носительницами вируса. Тест, проведенный в первые дни жизни, покажет, произошло ли внутриутробное инфицирование. Заражение могло случиться, когда ребенок проходил по родовым путям. Положительный ВИЧ-статус, приобретенный младенцем в процессе родов, удастся выявить через 2 – 3 недели.

Сколько времени делается анализ ПЦР, и где можно сдать

Проведение анализа ПЦР на ВИЧ и расшифровка результатов не требуют много времени. Забор крови занимает 5-7 минут. В стандартном случае лаборанту достаточно 24 часов, чтобы подготовить справку. Диагностирование занимает не более 8 часов, остальное время требуется на оформление. Пациент получает отчет на следующий рабочий день. Экспресс-тестирование выполняют в течение 2 часов.

Исследования на ВИЧ указанным способом не проводят по полису ОМС. Получить эту услугу бесплатно в государственной поликлинике нельзя. Зато практически все коммерческие лаборатории обычно имеют необходимое оборудование и реагенты. Проведение анализа ПЦР часто входит в общий скрининг на ВИЧ. Цена комплексной диагностики составляет от 600 до 1000 руб.

Читайте также:  На соске вылез прыщ

Пройти процедуру можно анонимно. В регистратуре пациенту дают индивидуальный номер, по которому он узнает результат. Современные медицинские центры отображают все данные на своем сайте в личном кабинете клиента.

Методика ПЦР-диагностирования первоначально была разработана 35 лет назад американским ученым Кари Муллисом. Изобретатель исследования получил международную Нобелевскую награду в 1993 году за свое новаторство. Оно стало незаменимым для любой лабораторной деятельности.

ПЦР используется в молекулярной биологии, чтобы произвести множество копий (амплифицировать) небольших участков ДНК. ДНК-полимераза может добавлять нуклеотид только в существовавшую ранее 3-OH-группу. Поэтому ему нужен праймер, к которому он может добавить первый нуклеотид. Это требование позволяет определить конкретный участок последовательности шаблонов, который необходимо диагностировать. В конце реакции ПЦР конкретная последовательность будет накапливаться в миллиардах копий (ампликонов).

ПЦР включает в себя процесс нагрева и охлаждения, называемый термическим циклом, который выполняется специализированной техникой. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является относительно простой методикой. Она усиливает ДНК-матрицу для получения специфических фрагментов ДНК in vitro (анализ в пробирке). Традиционные методы клонирования последовательности ДНК в векторе и ее репликации в живой клетке часто требуют проведения исследований от нескольких дней до нескольких недель работы. Но получить результаты амплификации последовательностей ДНК с помощью ПЦР можно спустя пару часов.

Большинство биохимических анализов, используемых в диагностике инфекционных заболеваний, требуют достаточно большого количества биологического материала. Для ПЦР данное условие не является обязательным. Таким образом, ПЦР может обеспечить более чувствительное обнаружение патогена. И более высокие уровни амплификации определенных последовательностей за меньшее время с достаточно ограниченным количеством биоматериала. Эти особенности делают технику чрезвычайно полезной. Не только в фундаментальных исследованиях, но и в личных целях. Включая тестирование генетической идентичности, судебную экспертизу, промышленный контроль качества.

Основная ценность анализа заключается в возможности выявления патологий, передаваемых половым путем, до развития первых признаков. К анализу методом ПЦР прибегают при необходимости ранней диагностики ВИЧ-инфекции. А также определения РНК вируса в крови донора. Благодаря высокой чувствительности анализа получить ответ можно спустя 7-14 дней после предполагаемого инфицирования. Достоверность диагностики будет достигать от 85 до 98%. Однако, тест ПЦР назначается не всем. Поскольку является достаточно дорогостоящим исследованием. Главное, требует наличия дорогого оборудования и определенных профессиональных навыков от сотрудников лаборатории. Если пациент ранее не находился в ситуациях, связанных с повышенным риском заражения, проведение полимеразной реакции не целесообразно.

Полимеразная реакция качественного типа на ВИЧ

Проведение качественного ПЦР на ВИЧ позволяет определить присутствие в организме вирусного заболевания. Пациент может получить результат в виде следующих отметок: положительный, ложноположительный, отрицательный. Но исследование не дает возможности определить количество копий ретровируса. Качественный анализ не проводится пациентам, у которых ранее была диагностирования инфекция. Не назначается в качестве контроля над эффективностью противовирусной терапии.

ПЦР количественного типа на ВИЧ

Проводится с целью определения копий РНК вируса в биологическом материале пациента. Количественный ПЦР назначается только больным с ранее выявленной инфекцией, как мониторинг проводимого лечения.

ПЦР в реальном времени

Используется в лабораторной диагностике для образования копий участков ДНК. Также для одновременного количественного исследования и детекции последовательности ДНК в биоматериале. По сути, диагностика представляет собой количественный ПЦР.

На заметку!

В различных лабораториях можно встретить несколько формулировок диагностики: «ПЦР количественное определение» и «ПЦР в режиме Real-time».

Оба анализа являются идентичными.

🔊 Прослушать пост

ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой метод молекулярной генетики, который позволяет анализировать любую короткую последовательность ДНК (или РНК) даже в образцах, содержащих только мельчайшие количества ДНК или РНК, тем самым определив наличие/отсутствие патогенного возбудителя (определить, например есть ли в человеке вирус ВИЧ или гепатита Б или микобактерии туберкулёза). ПЦР используется для воспроизведения/умножения/клонирования (амплификации) выбранных участков ДНК или РНК для анализа.

Метод ПЦР настолько прост, что его может поставить даже школьник)

Раньше амплификация ДНК включала клонирование сегментов, представляющих интерес, в векторы для экспрессии в бактериях и занимала недели. Но теперь, когда ПЦР делается в пробирках, требуется всего несколько часов. ПЦР является высокоэффективной, так что из ДНК может быть сделано огромное количество копий.

Более того, ПЦР использует те же молекулы, которые природа использует для копирования ДНК:

  • Два «праймера», коротких одноцепочечных последовательностей ДНК, которые синтезируются так, чтобы соответствовать началу и концу растяжения ДНК, подлежащей копированию.
  • Фермент, называемый полимеразой, который перемещается вдоль сегмента ДНК, считывает его код и собирает копию.
  • Куча блоков ДНК, которые необходимо сделать этой полимеразе.

То есть ПЦР — это такая техника при которой частицы ДНК (иногда РНК) умножаются в определенном растворе или на специальной поверхности, где они могут быть депонированы.

ПЦР — это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.

Ключом к пониманию ПЦР является знание о том, что каждый человек, животное, растение, паразит, бактерия или вирус содержит генетический материал — ДНК (или РНК) последовательности (нуклеотидные последовательности или кусочки ДНК (или РНК)), которые уникальны для каждого индивидуума. То есть, если образец содержит сегменты ДНК или РНК,

задача ПЦР как метода — умножить (амплифицировать), сделать как можно больше их копий, чтобы можно было идентифицировать кому они могут принадлежать (определенному человеку, животному или патогенному организму), даже если есть только следы наличия ДНК/РНК.

Однако ПЦР-амплификация является лишь частью диагностического теста. После проведения амплификации амплифицированные сегменты необходимо сравнить с другими нуклеотидными сегментами, но уже из известного источника (например, конкретного человека, животного или патогенного организма). Это сравнение уникальных сегментов часто выполняется путем размещения нуклеотидных последовательностей, сгенерированных ПЦР, рядом с известными нуклеотидными последовательностями от людей, патогенов или других источников в специальном геле.

Читайте также:  Болезнь вассермана что это

Когда электрический ток проходит через гель, то различные нуклеотидные последовательности образуют полосы, которые напоминают «лестницу» в соответствии с их электрическим зарядом и молекулярным размером. Это называется гель-электрофорез. Они мигрируют на одни и те же уровни в геле, показывая идентичность нуклеотидных последовательностей. Этот метод является одним из самых популярных последних этапов ПЦР-тестов.

Как ПЦР работает?

В 1983 году Кари Муллис разработал основные этапы по амплификации ДНК-последовательностей. Он и Майкл Смит были удостоены Нобелевской премии за создание ПЦР в 1993 году.

ПЦР проводится в одной пробирке с соответствующими химическими веществами и при определенной температуре нагревания.

Необходимы следующие реагенты или химикаты:

  • Образец, содержащий нуклеотидную последовательность (из крови, волос, гноя, кожи и т. д.).
  • ДНК-праймеры: короткая одноцепочечная ДНК, которая присоединена к нуклеотидным последовательностям, которая способствует синтезу комплементарной цепи нуклеотидов.
  • ДНК-полимераза: фермент, который, когда ДНК связывается с праймером, спускается по фрагменту ДНК с добавлением структурных блоков ДНК для образования комплементарных пар оснований и, таким образом, синтезирует комплементарную нуклеотидную цепь ДНК (введение термостойкой ДНК-полимеразы, Taq-полимеразы , полученной из термостойких бактерий, заметно улучшает способность к ПЦР).
  • Большой избыток структурных блоков ДНК, называемых нуклеотидами (аденин, тимидин, цитозин и гуанин, сокращенные как: A, T, C и G соответственно) в растворе. Когда эти блоки соединены вместе, они образуют нуклеотидную последовательность или одну нить ДНК. Когда эти строительные блоки связывают свой комплементарный строительный блок слабыми водородными связями (например, A будет связываться только с T и G только с C) образуется комплементарная нуклеотидная последовательность ДНК, которая связана с исходной одноцепочечной ДНК. Когда связывание завершается, комплементарная ДНК с двойной цепью образуется в определенной последовательности.

Кари Муллис очень интересный, прикольный дядечка, посмотрите как он интересно рассказывает, как он придумал ПЦР:

Он верит в астрологию, но не верит, что ВИЧ вызывает СПИД.)