Положительный контроль пцр

Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности. Однако, несмотря на простоту и удобство метода, существует ряд условий, невыполнение которых может привести к получению недостоверного или ложного результата.

Простой на первый взгляд метод имеет ряд "подводных камней", с которыми так или иначе приходится сталкиваться практически каждому специалисту лаборатории. К различным ошибкам могут приводить как отсутствие опыта в использовании данной методики, так и стереотипы мышления персонала, ранее работавшего в биохимических или бактериологических лабораториях, где иные требования к работе. В результате таких ошибок могут быть получены ложноположительные, ложноотрицательные или недостоверные результаты анализов.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа, – прежде всего, связанные с нарушением правил взятия, хранения и транспортировки клинического материала. Однако при диагностике могут допускаться и другие ошибки, которые могут быть не замечены сотрудником КДЛ при анализе результатов.

Все ошибки, допускаемые в лабораторной практике, можно разделить на три класса:

ошибки преаналитического этапа;

ошибки аналитического этапа;

ошибки постаналитического этапа.

1.Ошибки преаналитического этапа ПЦР-диагностики

Операции преаналитического этапа ПЦР-диагностики выполняются вне ПЦР-лабораторий, однако ошибки, допускаемые на этом этапе, оказывают едва ли не самое существенное влияние на результат исследования. Большинство этих ошибок невозможно выявить в ходе исследования, и, следовательно, существенно возрастает риск получения ложного результата. В связи с этим необходима совместная работа с различными подразделениями ЛПУ по разработке алгоритма взятия биоматериала и контроль его выполнения.

Взятие биологического материала.

Первой и самой существенной ошибкой преаналитического этапа ПЦР-диагностики является неправильный выбор места взятия биологического материала для исследования. Поскольку метод ПЦР является прямым, т. е. позволяет непосредственно выявить причину заболевания, а данном случае обнаружить патогенный микроорганизм, то биоматериал необходимо брать непосредственно в месте предполагаемой локализации инфекционного процесса. Исследование некоего "универсального материала", как, например, крови, не позволит определить наличие в организме патогена во всех случаях, за исключением тех, при которых возбудитель локализован именно в крови. В первую очередь это относится к патогенам, которые могут поражать многие органы и ткани, таким как, например, Chlamydia trachomatis или Мусоbасterium tuberculosis.

Chlamydia trachomatis могут поражать эпителий слизистой оболочки урогенитального тракта, эпителий конъюнктивы глаза и синовиальной полости. Следовательно, при подозрении на урогенитальный хламидиоз материалом для исследования должен служить соскоб из урогенитального тракта, при поражении глаз у новорожденного – соскоб из конъюнктивы глаза, при хламидийном артрите – пунктат синовиальной жидкости.

Мусоbасterium tuberculosis могут поражать практически любой орган и ткань организма человека, т. е. материал для исследования не должен быть одним и тем же при разных формах патологического процесса.

Таким образом, если у ребенка хламидиоз глаз, а для исследования взят образец из урогенитального тракта, а при туберкулезе почек для исследования берется мокрота, отрицательный результат не будет исключать факта инфицирования пациента.

Вторая ошибка на преаналитическом этапе – неправильное взятие материала на исследование.

Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация микроорганизмов в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР.

Например, Chlamydia trachomatis – облигатные внутриклеточные паразиты, следовательно, исследуемый материал должен содержать большое количество клеток эпителия . То есть при взятии материала для выявления этих микроорганизмов необходимо делать соскоб, а не мазок, поскольку в мазке Chlamydia trachomatis не будут обнаружены, даже если находятся в организме в значительном количестве.

При взятии материала из урогенитального тракта необходимо избегать ингибирующих примесей, таких как слизь, кровь или гной. Для этого соскобы берут не ранее, чем через два часа после мочеиспускания, у женщин учитывают дни цикла. Избыток слизи или гноя необходимо удалить стерильным ватным тампоном непосредственно перед взятием биоматериала. Забирать материал желательно специальными пластиковыми зондами, что снижает вероятность появления крови в образце, к тому же они, в отличие от ватных, не сорбируют транспортную среду и исследуемый материал.

Обработка биологического материала.

Правильное взятие урогенитального соскоба процедура болезненная для лиц мужского пола и детей, поэтому для исследования можно использовать первую порцию утренней мочи, содержащую максимальное количество эпителия. В последующем для работы необходимо получить клеточный осадок мочи. Однако следует учитывать, что осадок содержит большое количество солей и мочевины, которые при использовании технологий флуоресцентной детекции денатурируют зонды, что может привести к ложноположительным результатам. Поэтому клеточный осадок мочи необходимо в обязательном порядке промывать физиологическим раствором.

Следующая ошибка преаналитического этапа – неправильная обработка взятой крови. Для предотвращения свертываемости крови в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Во многих лабораториях в качестве антикоагулянта используется гепарин. Однако гепарин достаточно сильно ингибирует ПЦР, и независимо от используемой тест-системы и способа пробоподготовки все результаты для образца, его содержащего, окажутся недостоверными в случае наличия внутреннего контроля ПЦР или отрицательными, независимо от реального положения вещей в случае, если внутреннего контроля нет .

Хранение биологического материала.

Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК возбудителя может разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение нескольких часов, для более длительного хранения необходимо замораживание. Единственное исключение – кровь, поскольку цельную кровь замораживать нельзя! Необходимо получить плазму и уже ее замораживать. Заморозка должна быть однократной, в противном случае происходит разрушение нуклеиновых кислот.

2.Ошибки аналитического этапа ПЦР-диагностики

Ошибки в работе.

Ошибки аналитического этапа, как правило, связаны с невнимательным чтением инструкции, прилагаемой к набору для проведения ПЦР-анализа.

Одной из таких ошибок является неправильный выбор системы пробоподготовки. Менее опасно применение экспресс-методов дли сложных биоматериалов – таких как, например, плазма крови, потому что в этом случае наиболее вероятно получение недостоверных результатов из-за оставшихся в пробе ингибиторов ПЦР, что, в свою очередь, вынудит специалиста КДЛ повторить эксперимент и выяснить причину неудачи. Гораздо опаснее, если из-за неправильно выбранной тест-системы в процессе пробоподготовки теряется часть или вся ДНК или РНК возбудителя в этом случае есть риск получения ложноотрицательного результата.

Вторая ошибка – неправильно приготовленные фоновые пробирки для тест-систем с флуоресцентной детекцией но конечной точке. Чаще всего это связано с тем, что сотрудник лаборатории забывает их менять при появлении новой серии реактивов или не делает этого из соображений экономии. Возможно, что одни и те же компоненты реакционной смеси едва ли будут иметь различный уровень флуоресценции, однако в разных сериях реактивов могут отличаться концентрации компонентов и поэтому высока вероятность различного уровня флуоресценции. Таким образом, ошибка, влияние которой в некоторых случаях можно не заметить, в других может обусловить большое количество недостоверных результатов.

Еще одной ошибкой, связанной с неправильным приготовлением фоновых пробирок, является добавление в них полимеразы. Это может произойти как случайно, так и вследствие того, что лаборант не до конца понимает, почему полимеразу добавлять не нужно. Здесь могут быть два варианта развития событий: если в тест-систему не входит внутренний контроль или в качестве отрицательного контрольного образца используется буфер, не прошедший выделения, и если в тест-систему входит внутренний контроль, который находится под парафином, и/или отрицательный образец проходит стадию выделения. В первом случае добавление полимеразы может существенно не сказаться на результате, однако и в этом случае есть риск контаминации как положительным, так и внутренним контролем. Во втором случае все отрицательные значения оказываются недостоверными. Обнаружить ошибку не представляется проблемой, поскольку нормировочные значения оказываются очень высокими, близкими к 10′, а значения флуоресценции в некоторых пробирках существенно ниже 1.

Проблема контаминации возникает при неправильной организации работы лаборатории или при неаккуратном обращении с положительными образцами. Так, при использовании гель-электрофореза в качестве метода детекции комната для его проведения обязательно должна иметь отдельный вход и систему вентиляции. В противном случае вероятность того, что ампликоны из открывающихся пробирок будут попадать в другие помещения, очень высока. Это может привести к тому, что со временем все больше исследуемых образцов на часто встречающиеся инфекции будут оказываться положительными. При этом на первых этапах такого загрязнения отрицательный контроль может оставаться чистым, поскольку появление ложноположительных результатов носит статистический характер.

В случае флуоресцентной детекции пробирка не открывается и теоретически вероятность контаминации близка к нулю, однако возможность ее открытия не исключена. Поэтому лучше, если амплификация и детекция будут проводиться в отдельной комнате, тогда в случае непредвиденной ситуации контаминированной окажется одна комната.

Читайте также:  Кистозная мастопатия молочных желез лечение народными средствами

Еще одна ошибка, приводящая к контаминации образцов, связана с неаккуратным обращением как с клиническими пробами, так и с положительными контрольными образцами и стандартами. Некоторые специалисты лаборатории с целью экономии при внесении в большое количество пробирок одного и того же вещества используют один наконечник. Это возможно, если пробирки пустые или их содержание одинаково (подготовка амплификационных пробирок). Однако, если в пробирке находится образец, как, например, при пробоподготовке, то при внесении даже одного и того же раствора в разные пробирки увеличивается риск переноса ДНК – так называемая кросс-контаминация. С целью предотвращения кросс-контаминации также рекомендуется для внесения образцов, потенциально содержащих ДНК, использовать наконечники с фильтрами.

Помимо этого при неаккуратной работе есть риск внести в пробу ингибиторы (например, тальк с перчаток).

Ошибки при интерпретации результата

Говоря об ошибках при интерпретации результатов, имеет смысл рассмотреть различные способы детекции.

При детекции с использованием гель-электрофореза есть риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности четко и однозначно сравнить с положительным контролем и, в идеале, с маркером длин.

В случае нарушений правил работы существует риск контаминации уже на этапе детекции. Такого рода контаминация отслеживается в случае, если полоса наблюдается в заведомо отрицательной пробе, однако она неотличима от контаминации в лаборатории и требует повторной проверки всех образцов.

Одной из ошибок интерпретации, связанной с использованием метода флуоресцентной детекции по конечной точке, является невнимательное отношение к нормировочным значениям фоновых пробирок и к значениям флуоресценции в отрицательных пробах. Так, при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются (от нескольких часов до нескольких дней), при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены. Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к единице или, в редких случаях, чуть выше. Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже единицы, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.

Помимо вышеприведенного примера, может случиться так, что фоновая флуоресценция возрастает в амплификационных пробирках, в то время как в фоновых пробирках флуоресценция остается неизменной. Такая ситуация может возникнуть когда амплификационные пробирки хранятся при комнатной температуре. В этом случае будет увеличиваться содержание положительных результатов с низкими значениями флуоресценции. Результаты при этом получаются такие же, как при контаминации в лаборатории, однако в данном случае все низкие значения флуоресценции будут примерно одинаковы, что ц случае контаминации встречается достаточно редко, поскольку маловероятно, что во все отрицательные пробирки попадет равное количество постороннего материала. Подобного легко избежать, если менять фоновые пробирки раз в месяц-полтора, в этом случае, как правило, не успевает появиться достаточно большая разница между уже готовыми фоновыми и амплификационными пробирками.

Наиболее частая ошибка при исследовании методом ПЦР с де
текцией результатов в режиме реального времени связана с прибором, который при больших колебаниях флуоресценции может зафиксировать ложноположительные результаты.

В связи с этим необходимо проводить анализ индивидуальной кривой. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную кривую и области начала экспоненциального роста, и это не один из множества пиков колебания флуоресценции. Также прибор может выдать ложноотрицателъный результат в случае, если на первых циклах ПЦР по каким-то причинам произошло существенное уменьшение флуоресценции. Эту ошибку можно обнаружить при анализе исходных кривых флуоресценции. Если образец положительный, то на исходной кривой будет виден четкий экспоненциальный рост. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную кривую с кривой заведомо положительной. Все положительные кривые имеют сходный угол наклона, и уровень флуоресценции при выходе на плато заметь" но отличается от колебаний и отрицательных образцах.

3.Ошибки постаналитического этапа ПЦР-диагностики

Ошибки на завершающем, постаналитическом этапе связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.

Например, контрольное исследование на хламидиоз через 1 неделю после окончания курса антибиотиков даст положительный результат. Врач сделает вывод о неэффективности проведенной терапии. Однако окончательный вывод можно сделать не ранее чем через 4-6 недель, после того, как сменится эпителиальный слой, в котором паразитирует данный микроорганизм. Более ранняя диагностика может показать неверный результат, поскольку в клетках эпителия еще сохраняются погибшие микроорганизмы. Важно учитывать специфичность используемых тест-систем. Так, например, пациент с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направляется на исследование. При постановке ПЦР используется видоспецифическая тест-система для выявления ДНК С. Trachomatis результат исследования отрицательный. Однако врач не должен снимать предполагаемый диагноз, поскольку инфекция может быть вызвана другими видами хламидий, например С. рneumoniа, С. ресоrum, С. psitaci,которые не диагносцируются данной тест-системой. То есть при назначении ПЦР-исследования врач должен очень четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.

Вместе с тем несовпадение результатов различных методов исследования не говорит об ошибке. Зачастую ПЦР-исследование дает положительный результат, в то время как ИФА – отрицательный. Несовпадение результатов исследований может объясняться, например, периодом "серологического окна".

В случае обратных результатов исследований возможен "иммунологический след" – остаточный уровень антител, который у некоторых людей может сохраняться многие месяцы и даже годы после выздоровления, либо при проведении ПЦР не учитывается видоспецифичность тест-систем.

Приведенные примеры показывают, что для получения качественных результатов исследований необходимо четкое выполнение правил работы на всех этапах клинической лабораторной диагностики и тесная взаимосвязь специалистов ПЦР-лаборатории с врачами-клиницистами.

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология . Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология . Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови . Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний . К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология . ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.
Читайте также:  Каутеризация яичников что это

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
    • Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
    • Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
    • Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
    • Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
    • Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

    Цены на ПЦР-диагностику

    Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

    Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

    Название анализа Цена, руб.
    Определение ДНК хламидия 750
    Определение ДНК микоплазмы хоминис 540
    Определение микоплазмы гениталиум 350
    Определение ДНК уреаплазмы 350
    Гонококк, определение ДНК 350
    Определение ДНК герпеса (разные типы) 350–600
    Определение ДНК кандиды 570
    Вирус краснухи, определение РНК 800
    Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы) 350–1900 [1]

    Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 [2] рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 [3] рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.

    Название Министерство здравоохранения республики узбекистан ташкентская медицинская академия «утверждаю» проректор по учебной работе тма, проф. Тешаев О. Р
    страница 3/3
    Дата 18.08.2013
    Размер 360.24 Kb.
    Тип Протокол
    скачать
    Читайте также:  Киста яичка по мкб 10
    1. /Методичка ПЦР 1 2013.doc Министерство здравоохранения республики узбекистан ташкентская медицинская академия «утверждаю» проректор по учебной работе тма, проф. Тешаев О. Р

    КОМНАТА ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ

    В комнате для амплификации должна оборудоваться амплификатором. Все современные амплификаторы можно разделить на модели с возможностью детекции накопления ДНК во время реакции детектирующие амплификаторы, и не детектирующие – обычные амплификаторы. Детектирующие амплификаторы пременяемые для проведение ПЦР реального времени, в сравнении с обыч­ными амплификаторами, оснащены дополнительной оптичес­кой насадкой, позволяющей регистрировать флуоресценцию в закрытой реакционной пробирке (через прозрачную крышку или стенки пробирки) непосредственно во время реакции.

    SLAN

    двух канальный детектирующий

    амплификатор блочного типа на 48 пробирок (Китай)

    iQ5

    амплификатор блочного типа на

    96 пробирок (США)

    амплификатор роторного типа со

    сменными роторами (Австралия)

    КРАТКОЕ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЦР-РВ

    КОНТРОЛЬ ПРОБЛЕМА ВОЗМОЖНАЯ ПРИЧИНА УСТРАНЕНИЕ
    1 K+ Нет специфической полосы Перепутывание mix1 и/или контролей

    Проблемы с реактивами

    перестановка ПЦР 2 K- Полосы ПК, ВК контаминация перестановка ПЦР, меры по предотвращению 3 ПKO Отсутствуют или слабые полосы специфического сигнала/ВКО при наличии полосы К+ потери при выделении

    Испортились реактивы ПКО/ВКО

    Перевыделение

    Развести ПКО и ВКО в 20 раз в ТЕ, поставить в ПЦР

    4

    OKO

    нет полосы ВКО аналогично как для ПКО аналогично как для ПКО наличие полосы ПК контаминация перевыделение, меры по предотвращению

    Пример кривой амплификации – ПЦР-РВ полученный в

    ТЕРМИНЫ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

    Амплификация: процесс многократного копирования специфического участка ДНК (кДНК), ограниченного (фланкированного) праймерами.

    Амплификатор: прибор предназначенный для проведения ПЦР. Ампликоны: продукты ПЦР, синтезируемые в процессе ампли-фикации копии ДНК-мишени.

    Внутренний контроль ПЦР-анализа – это: препарат ДНК/РНК, добавленный к каждому исследуемому образцу на этапе обработки биологического материала, который проходит через все стадии ПЦР-анализа – экстракция НК, ОТ, ПЦР, на этапе детекции результат амплификации ВК позволяет судить о качестве проведения ПЦР-анализа в целом, а не отдельных его этапов. Отрицательный результат образца при отсутствии сигнала по внутреннему контролю говорит о недостоверности отрицательного результата образца.

    ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота. Состоит из азотистых оснований аденина, гуанина, цитозина, тимина, дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты.

    Контаминация НК – механический занос положительно реагирующих НК, прежде всего ампликонов, в исследуемые образцы, приводящий к ложноположительным результатам.

    НК- нуклеиновые кислоты т.е. ДНК и РНК.

    Отрицательный контроль ПЦР-анализа – контрольный образец который не содержит ДНК мишень. Положительный результат в отрицательном контрольном образце свидетельствует о загрязнении оборудования или реактивов продуктами ПЦР предыдущих исследований.

    Полимеразная цепная реакция ПЦР-анализа – это имитация естественного процесса синтеза ДНК в лабораторных условиях с последующим (классический ПЦР, FLASH) или параллельным определением (Real-time ПЦР) продуктов амплификации.

    Положительный контроль – контрольный образец который содержит ДНК мишень. Положительный контрольный обра­зец, в котором реакция должна пройти обязательно, от­сутствие результата в положительном контрольном образце будет свидетельствовать об ошибках в приготовлении реакции или испорченных реактивах.

    РНК – Рибонуклеиновая кислота. Состоит из азотистых оснований аденина, гуанина, цитозина, урацила, рибозы и остатка фосфорной кислоты.

    Taq – полимераза: термостабильный фермент, используемый при амплификации.

    *А. Это имитация естественного процесса синтеза ДНК в лабораторных условиях.

    В. Это метод основанный на определении комплекса антигена с антителом с помощи ферментов.

    С. Это метод определения антигенов с помощи антител сорбированных на поверхности латексных частиц.

    D. Это процесс синтеза ДНК на основе РНК.

    Е. Это метод определения веществ основанный на принципе «молекулярных весов».

    2.Какие виды ПЦР вы знаете?

    А. ПЦР реального времени, ПЦР классика

    В. FLASH, Реальный ПЦР, хроматография

    С. Классический ПЦР, электрофорез

    *D. Классический ПЦР, FLASH, ПЦР реального времени

    Е. Электрофорез, ВЭЖХ

    3.К основным компонентам ПЦР относятся?

    *А. Праймеры, Таq-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, ПЦР буфер, ДНК мишень

    В. Минеральное масло

    С. Плашка, конъюгат, субстрат, хромоген

    D. Антитела к гормонам или другим аналитам нанесенных на чипе созданной на основе нанотехнологии

    Е. Все ответы верны

    4. Как называется прибор предназначенный для проведения ПЦР?

    *А. Амплификатор, термоциклер, циклотермостат , ПЦР анализатор

    В. Термоциклер, плашечный спектрофотометр

    С. Циклотермостат, вертикальный спектрофотометр

    D. ПЦР анализатор, ПЦР катализатор, стриповый ИФА-ридер

    Е. Все ответы верны

    5.Что из себя представляет прибор предназначенного для ПЦР реального времени?

    *А. Это циклотермостат совмещенный с флюориметром

    В. Это вертикальный спектрофотометр совмещенный с миксером

    С. Это масс-спектрометр совмещенный с ВЭЖХ

    D. Это горизонтальный спектрофотометр с термостатом и проточной кюветой

    Е. Все ответы верны

    6. Что означает слова контаминация?

    Е. Все ответы верны

    7. Укажите основные правила взятия материала для ПЦР исследований?

    *А. Правильный выбор места и времени взятия образца в зависимости от локализации и патогенеза возбудителя

    В. Правильный выбор времени взятия биоматериала в зависимости от патогенеза возбудителя

    С. Взять большое количество образца

    D. Правильный выбор места взятия образца в зависимости от локализации возбудителя

    Е. Все ответы верны

    8. Почему клетки разных органов человеческого организма синтезируют разные белки, хотя каждая клетка организма содержит одинаковую генетическую информацию (ДНК)?

    А. Потому что некоторые клетки не содержат ДНК например эритроциты

    *В. Потому что в клетках «не работают» части ДНК которые связаны с гистонами.

    С. Это неизвестно

    D. Каждая клетка имеет свою специфическую ДНК

    Е. Все ответы верны

    9. Соответствуетли правила классической генетики «один ген = один белок» к понятиям современной геномики и протеомики?

    А. Это до сих пор не изучено

    *В. Молекулярно-биологические и протеомные исследования доказали не достоверность этой правилы, это доказывает и тот факт что виды белков в организме в сотни раз больше чем количества генов

    С. Это так потому что количества генов в организме в сотни раз больше чем виды белков

    D. Это понятие как было так и остаётся «золотым законам» генетики

    Е. Все ответы верны

    10. Какие виды ПЦР применяются при вирусных гепатитах?

    А.Качественный ПЦР в том числе определения вирусов в моно-нуклярах – для подтверждения диагноза

    B.Определения YMDD, YVDD мутации вирусов-для оценки лекарственной устойчивости вирусов (при ВГВ)

    C. Генотипирование-для установления срока лечения болезни (при ВГС)

    D. Количественный ПЦР-для оценки эффективности лечения

    *Е. Все ответы верны

    1. Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции. Мет. рекомен. / Под редакцией Помогаевой А.П., Томск -2000. -40 с.
    2. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Мет. пособие/ Болдырева М. Н., Донников А Е, Тумбинская Л В. Москва- 2009.-42 с
    3. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинической практике. Мет. Рекомен./ А.А.Бонецкий, М.М.Таирова, Т.С.Кутукеев и др. Бишкек – 2000.-12 с.
    4. ПЦР «в реальном времени» / под ред. Д.В. Ребрикова 2-е изд., испр. и доп.-М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.-223 с. : ил.
    5. ПЦР-диагностика: выбор, взятие, транспортировка и хранение биологического материала. Мет. рекомнен. /под ред. Ариповой Т.У. Ташкент. 2010. -29 с.
    6. Урогенитальный хламидиоз. Мет. рекомен / под. Ред Говоруна В.М. Москва-2009. -60 с.
    7. Dang C, Jayasena S. D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA poly­merase facilitate detection of low copy number targets by PCR //J Mol Biol., 1996, 264:268-278.
    8. Findlay J. В., Atwood S. M., Bergmeyer L., Chemelli J., Christy K., Cummins Т., Donish W„ Ekeze Т., Falvo J„ Patterson D., et al. Auto­mated closed-vessel system for in vitro diagnostics based on polymer­ase chain reaction // Clin. Chem., 1993, 39:1927-1933.
    9. Horton R. M., Hoppe B. L., Conti-Tronconi В. M. AmpliGrease: «hot start» PCR using petroleum jelly//Biotechniques, 1994,16:42-43.
    10. Kellogg D. E., Rybalkin I., Chen S., Mukhamedova N., Vlasik Т., Siebert P. D., Chenchik A. TaqStart Antibody: « hot start» PCR facili­tated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase // Biotechniques, 1994, 16:1134-1137.
    11. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L„ Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR // Nucleic Acids Res., 1999,27:1558-1560.

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Adblock detector